ArbeitsgruppenAG Carlomagno
RNA-Untersuchung durch Fest Phasen NMR

RNA studies by solid state NMR

FESTKÖRPER-NMR

Mit der Untersuchung großer RNP-Komplexe begaben wir uns auf neues Terrain: die Festkörper-NMR (ssNMR, solid state NMR). Die ssNMR eignet sich besonders gut für große Komplexe, da die Linienbreite unabhängig von der Molekülgröße ist. Wir glauben, dass die ssNMR-Spektroskopie bei der Untersuchung von RNP-Komplexen bisher noch unerforschtes Potential besitzt. Als Vorreiter bei der Anwendung von ssNMR zur Untersuchung von RNA-Protein-Wechselwirkungen haben wir neue Methoden zum Nachweis von Atomkontakten an den RNA-Protein-Grenzflächen aufgestellt (1,2). Außerdem haben wir Techniken zur Zuordnung von RNA-Resonanzen in der Festkörper-NMR entwickelt, die eine Voraussetzung für die Strukturbestimmung der Nukleinsäurekomponenten von RNP-Komplexen sind.

Vor kurzem haben wir einen Meilenstein in der RNA-Strukturbiologie erreicht, indem wir die erste de novo-Struktur von RNA mit ssNMR gelöst haben (Abbildung 1). Wir haben gezeigt, dass die RNA-Strukturaufklärung mit hoher Auflösung durch ssNMR möglich ist unter Verwendung weniger einfach zu präparierender Nukleotid-selektiv markierter Proben. Die Methodik kann mit der segment-basierten RNA-Markierung kombiniert werden, um die Struktur von ganzen RNA-Abschnitten in hochmolekularen zellulären Maschinen zu bestimmen, und sie ermöglicht es mechanistische Untersuchungen von noch nicht zugänglichen RNA-Protein-Komplexen durchzuführen.

Abb 1. Links: Schematische Darstellung der ssNMR-Experimente zur Resonanzzuordnung und Strukturbestimmung der RNA mittels ssNMR. Rechts: Dreidimensionale Struktur der 26mer Box C / D-RNA, gebunden an das Protein L7Ae (Protein nicht gezeigt), bestimmt durch ssNMR-Beschränkungen (grün, K-turn-Bereich; blau, NC- und C-Stämme; grau, Schleife) .

 
Verweise

1. Asami, S., Rakwalska-Bange, M., Carlomagno, T. & Reif, B. Protein-RNA-Grenzflächen, die durch 1H-detektierte MAS-Festkörper-NMR-Spektroskopie untersucht wurden. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2345–9 (2013).

2. Jehle, S. et al. Intermolekulare Protein-RNA-Wechselwirkungen, die durch 2D-31P-15N-Festkörper-NMR-Spektroskopie im Spinnwinkel nachgewiesen wurden. Marmelade. Chem. Soc. 132, 3842–6 (2010).

3. Marchanka, A., Simon, B. & Carlomagno, T. Eine Reihe von Festkörper-NMR-Experimenten zur Zuweisung von RNA-Intranukleotid-Resonanz in einem 21-kDa-Protein-RNA-Komplex. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 9996–10001 (2013).

4. Marchanka, A., Simon, B., Althoff-Ospelt, G. & Carlomagno, T. RNA-Strukturbestimmung durch Festkörper-NMR-Spektroskopie. Nat. Commun 6, 7024 (2015).