ArbeitsgruppenAG Carlomagno
RNA-Metabolismus

RNA metabolism

Die Editierung und Modifikation von RNA sind posttranskriptionelle Prozesse, die in allen Organismen vorkommen und viele biologische Funktionen beeinflussen, wie z. B. das Splicing, die miRNA-Regulation und die Kontrolle der Proteinbiosynthese und der mRNA-Integrität. Es sind bereits mehr als 100 verschiedene Arten an modifzierten Nukleotiden in rRNA, mRNA und tRNA identifiziert worden, was auf eine erstaunliche Vielfalt der Kontrollmechanismen, die die RNA-Funktion durch Modifikationen beeinflussen, schließen lässt. Es wurde gezeigt, dass Fehler in diesen RNA-Modifikationsmustern beim Menschen diverse Erkrankungen verursachen kann. Darüber hinaus werden einige Krankheitserreger einer umfangreichen Bearbeitung ihrer mRNA unterzogen, um eine funktionelle Proteinexpressionsmaschinerie zu erhalten. Trotzdem sind RNA-editierende Enzyme immer noch unerforschte Klasse von Wirkstoffzielen.

Während der Ribosomenbiogenese treten posttranskriptionelle Modifikationen von Ribonukleotiden in funktionell wichtigen Regionen von prä-rRNA-Transkripten auf, wie z. B. an den Schnittstellen verschiedener Untereinheiten,  und in den Bereichen die an der Dekodierung und am Peptidyltransfer beteiligt sind. Unter diesen Modifikationen ist insbesondere die Methylierung von 2'-O-Ribose interessant, da diese Modifikation die RNA vor ribonukleolytischer Spaltung schützt, einzelne Basenpaare stabilisiert, außerdem als Chaperon dient und bei hohen Temperaturen die Faltung beeinflusst. Defekte im Methylierungsmuster von mRNA wurde bereits mit neurologischen Erkrankungen korreliert, und Wissenschaftler vermuten, dass diese Modifikation bei weit mehr Erkrankungen eine Rolle spielt als bisher bekannt ist. Es wurde zum Beispiel gezeigt, dass diese Art der Methylierung von RNA an der viralen Replikation und an der immunologischen Abwehr des Wirts beteiligt ist, da hiermit ein Mechanismus bereitgestellt wird, um virale von der endogenen RNA zu unterscheiden.

In Eukaryoten und Archaeen wird die 2'-O-Ribose-Methylierung durch den Box C/D small (nucleolar) RNA-Protein-Komplex (s(no)RNP) durchgeführt. Dieser Enzymkomplex befindet sich im Nucleolus und bindet an snoRNAs, die Box C/D und Box C‘/D‘ Motive enthalten. Archaeale Box C/D-sRNPs beinhalten drei Kernproteine: Fibrillarin, das die Methylierungsreaktion katalysiert und äquivalent zum eukaryotischen Nop1 ist; Nop5, ein Homologes zu den eukaryontischen Proteinen Nop56 und Nop58; und L7Ae, das homolog zum eukaryotischen Snu13 ist. Darüber hinaus bindet die guide sRNA zwei verschiedene Substrat-RNAs (10-21 bp lang) und markiert hierbei die Methylierungsstellen, die sich fünf Nukleotide stromaufwärts vom Box D und D' Motiv befinden.

In Lapinaite et al. 2013 (1) zeigen wir die Struktur des 390 kDa Box C/D-RNP-Komplexes in zwei verschiedenen Zuständen während der Katalyse. Trotz vieler Jahre an biochemischen Untersuchungen und Kristallisationsexperimente waren die Struktur und der genaue Funktionsmechanismus dieses lebenswichtigen, zellulären Enzyms umstritten. Unsere Arbeit verfolgte jedoch einen interdisziplinären Ansatz, der aus einer Kombination von (i) bereits verfügbaren hochauflösenden Strukturen der komplexen Komponenten, (ii) flüssig-Phasen NMR- und SANS-Daten (Small Angle Neutron Scattering)  (s. Abb. 1a und b) und (iii) zusammenführendem molekularem „Docking“ bestand. Dadurch konnten wir die Struktur des Box C/D-Enzymkomplexess sowohl in seiner inaktiven (ohne Substrat-RNA) als auch in seiner aktiven (mit Substrat-RNA) Form lösen. Es wurde eine starke Konformationsänderung bei der Bindung des Substrates festgestellt, die eine unvorhergesehene dreidimensionale Organisation des katalytischen RNPs und einen Mechanismus zur Regulation der Methylierung an verschiedenen rRNA-Stellen aufzeigte. Dieser unerwartete Regulationsmechanismus eröffnete eine neue Sicht auf die Bedeutung der RNA-Methylierung und lässt vermuten, dass die sequentiell geordnete Methylierung dazu dienen könnte, die rRNA während der Ribosomenbiogenese zu produktiven Faltungswegen zu führen.

Figure 1. Strukturen von apo (a) und holo (b) Box C / D RNP. L7Ae, grün; Nop5, grau; Fibrillarin, blau; Box C / D-RNA, gelb. Eine starke Konformationsänderung tritt bei der Substratbindung auf. Der Komplex verlängert sich und die RNA-Substrate D (Firebrick Red) und D '(Lachs) besetzen unterschiedliche Umgebungen. Nur zwei der vier Fibrillarinmoleküle kontaktieren die Substrat-RNA zur Methylierung. Die Methylierung der beiden anderen Substrat-RNAs erfordert dann eine zusätzliche Konformationsumlagerung, bei der die Position der Substrate D und D 'ausgetauscht wird. Somit erfolgt die Methylierung der Substrate D 'und D sequentiell.

Regulatorische RNAs

Wenn Transposons in Keimzellen nicht unterdrückt werden, verursacht dies DNA-Schäden, die zu einer fehlerhaften Gametogenese und Problemen mit der Fruchtbarkeit führen können. piRNAs sind eine neuartige Klasse innerhalb der nicht-kodierenden (nc)RNAs, mit einer Kettenlänge von 24-32 Nukleotiden, die die Unterdrückung von transponierbaren Elementen in der tierischen Keimbahn unterstützen. Die Neuheit dieser Moleküle ist nicht nur auf ihre Länge beschränkt, sondern auch auf ihre Fähigkeit mit den PIWI-Proteinen der Argonaute Familie zu interagieren und auf ihre RNase III unabhängige Synthese.

piRNA-Vorläufer werden im Nukleus als ssRNA synthetisiert, und werden dann zu kleineren piRNA-Fragmenten verarbeitet um schließlich mit PIWI-Proteinen beladen zu werden. Derzeit ist über den Mechanismus hinter diesem Prozess wenig bekannt. Wir wissen jedoch, dass eine Erhöhung der piRNA-Menge durch einen zusätzlichen, sekundären Weg erreicht werden kann, in welchem piRNAs über einen Ping-Pong-Mechanismus vermehrt werden können. In Drosophila wird diese sekundäre Biogenese durch das PIWI-Protein Aub und AGO3 vermittelt.

Der Ping-Pong-Zyklus findet in der nuage statt, der Ort an dem die PIWI-Proteine ​​ko-lokalisieren. Es ist bekannt, dass PIWI-Proteine ​​Arginin-Methylierungen aufweisen, die von Mitgliedern der Tudor-Familie erkannt werden. Dies hilft die Ko-Lokalisierung der PIWI-Proteine ​​zu erleichtern. Diese Tudordomänen-haltigen Proteine ​​fungieren jedoch nicht nur als Plattform für den Ping-Pong-Zyklus, sondern sie beteiligen sich auch aktiv an der Kontrolle des piRNA-Spiegels durch Regulierung des Verhältnisses von sense zu antisense piRNAs in der Zelle.

Trotzdem bleiben die mechanistischen Details dieser Prozesse immer noch schwer fassbar. Unser Labor zielt daher darauf ab, die Rolle der Tudordomänen-haltigen Proteine, die am ​Ping-Pong-Zyklus beteiligt sind mithilfe verschiedener biophysikalischer Methoden wie NMR, SAS und Kristallographie aufzuklären.