ArbeitsgruppenAG Carlomagno
Integrative Strukturbiologie

Integrative Structure Biology

INTEGRATIVE METHODEN ZUR STRUKTURBESTIMMUNG

Um neue Medikamente entwickeln zu können, ist es notwendig, die molekularen Grundlagen einer Krankheit zu entschlüsseln. Es ist daher wichtig, die zellulären Prozesse die einer Erkrankung zugrunde liegen zu verstehen und nachzuvollziehen, wie sie reguliert werden.

Unsere Forschung konzentriert sich auf die strukturelle und funktionelle Biologie großer biomolekularer Komplexe mit enzymatischer Aktivität, insbesondere von Protein- und RNA-Protein (RNP)-Komplexen. Unsere Philosophie ist es diese Komplexe(?) während ihres Funktionszyklus in mehreren Schlüsselstufen abzubilden. Hierfür verfolgen wir einen integrativen Ansatz, bei dem Strukturdaten auf mehreren Auflösungsebenen kombiniert werden.  Wir verwenden diese "dynamische" Strukturbildgebung zur Aufklärung der molekularen Grundlagen der Aktivität und Regulation von Molekülkomplexen. Anschließend nutzen wir dieses Wissen, um niedermolekulare Bindepartner zu designen, die die enzymatische Aktivität des Komplexes modulieren können, entweder für darauffolgnde In-vivo-Funktionsstudien oder um gänzlich neue Wirkstoffe zu entwicklen.

 

 

Strukturbiologie, Biophysik und In-Silico-Modellierung sind etablierte Ansätze, um die funktionellen und regulatorischen Mechanismen von Enzymen aufzudecken, die sowohl aus Proteinen als auch aus Protein-Nukleinsäure-Komplexen bestehen. Dank der jüngsten Hard- und Softwareentwicklungen verspricht die Elektronenmikroskopie (EM), die Kristallisation zur Strukturbestimmung jedes stabilen Biomolekularkomplexes als Standardmethode abzulösen. Trotz dieser Fortschritte ist es weiterhin eine Herausforderung, die dynamischen biomolekularen Veränderungen  eines Komplexes während seines Funktionszyklus zu verstehen, sowie die Natur transienter Wechselwirkungen. Dynamik und transiente Wechselwirkungen sind die Grundlagen sowohl der Enzymprozessivität als auch dessen Regulation; in diesem Zusammenhang sind strukturbiologische Techniken wichtig, die mit einer Heterogenität von Konformationen, strukturellen Veränderungen oder dynamischen Prozessen umgehen können.

 

Unter ihnen sind die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), die Kleinwinkelstreuung (SAS), die elektronenparamagnetische Resonanz (EPR), durch Massenspektrometrie nachgewiesene Vernetzungen und die Fluoreszenz (FRET) die bekanntesten.

Meine Gruppe verfügt über ein erstklassiges Know-how in der NMR-Spektroskopie und SAS sowie deren Kombination mit EPR- und Röntgenkristallographie. Erst kürzlich haben wir begonnen, Expertise in der Analyse von EM-Daten zu entwicklen – Daten, die wir mit Kooperationspartnern gewonnen haben. Das große Potenzial der Strukturbiologie liegt in der Komplementarität aller hierin verfügbaren Techniken. Entsprechend dieser Idee entwickelt meine Gruppe integrative Methoden zur Strukturbestimmung (Abb. 1, Karaca et al., Nature Methods 2017).

Abb. 1 Integrative Computer-gestützte Werkzeuge können komplementäre, spärliche Daten mit unterschiedlichen Auflösungsgraden in genaue Strukturinformationen übersetzen (RDC, durch NMR detektierte Residual-Dipolar-Kopplungen; PCS, durch NMR detektierte Pseudokontaktverschiebungen; PRE, NMR-detektierte paramagnetische Relaxationsverstärkung; EPR, Electron Paramagnetic Resonance; FRET, Foerster-Resonanzenergietransfer; EM, Elektronenmikroskopie; SAXS, Kleinwinkel-Röntgenstreuung).

Die NMR ist eine der wichtigsten Techniken in unserem Portfolio, da die Experimente in Lösung stattfinden können und hierbei sowohl strukturelle als auch dynamische Eigenschaften der einzelnen Atompositionen ohne Einbringung chemischer Modifikationen erfasst werden können. Lange wurde diese Technik als ungeeignet für Moleküle mit hohem Molekulargewicht betrachtet, jedoch haben jüngste Entwicklungen in Hardware und Methodik die Anwendbarkeit von NMR auf Komplexe bis zu 1 Mda möglich gemacht. Mit einer Kombination aus NMR-Spektroskopie, SAS und biochemischen Daten lösten wir 2013 die Struktur(en) des archaealen Box C / D sRNP-Enzyms (Molekulargewicht ~ 400 kDa), das für die 2'-O-Ribose-Methylierung von ribosomaler RNA verantwortlich ist (Abb. 2). Bei Bindung des Substrates an dieses Enzym wurde eine starke Konformationsänderung festgestellt, die eine unerwartete dreidimensionale Organisation des katalytischen RNP-Komplexes zeigte und einen Mechanismus für die Regulation der Methylierung an verschiedenen rRNA-Stellen enthüllte (Lapinaite et al. Nature, 2013). Mittlerweile haben wir diese integrative Strukturbiologie auf drei weitere Komplexe im Zusammenhang mit RNA-Editierung, Histon-Modifikation und Peptidsynthese angewendet.

Abb. 2 Struktur der mit Substraten beladenen RNA-Methylierungsmaschine Box C / D RNP (Nature, 2013).

Mit der Untersuchung großer RNP-Komplexe gelangten wir in das Gebiet der Festkörper-NMR (ssNMR). Die ssNMR eignet sich besonders für große Komplexe, da die Qualität der Spektren unabhängig von der Molekülgröße ist. Hierbei weisen die Proben natürlich nicht die gleiche Dynamik wie in Lösung auf, jedoch erfordert die Probenvorbereitung für die ssNMR keine Kristallisation, und es bleibt dennoch ein hoher Grad an Hydratation erhalten. Als Pioniere bei der Anwendung von ssNMR zur Untersuchung von RNA- und RNA-Protein-Komplexen haben wir die erste de novo-hochauflösende Struktur von RNA durch ssNMR-Daten bestimmen können (Marchanka et al. Angew. Chemie. 2013; Marchanka et al. Nature Commun. 2015). Wir glauben, dass die ssNMR-Spektroskopie noch unerforschtes Potentioal insbesondere im Bereich der RNP-Strukturauflösung bietet.

Am BMWZ sind wir in folgenden Forschungsgebieten tätig:

1. RNA-Editierung, Modifikation und Metabolismus.

2. Allosterische Proteinregulierung bei Krebserkrankungen.

3. Proteinabbau in Bakterien und Eukaryoten durch sog. Unfoldasen.

4. Nicht-ribosomale Peptidsynthetasen.

5. Weiterentwicklung der hier beschriebenen Methoden.

 

Referenzen

1. Karaca, Rodrigues, Graziadei, Bonvin, Carlomagno “An Integrative Framework for Structure Determination of Molecular Machines” Nature Methods 2017 14, 897–902

2. Lapinaite, Simon, Skjaerven, Rakwalska-Bange, Gabel, Carlomagno “The structure of the Box C/D enzyme reveals regulation of rRNA methylation” Nature 2013 502, 519-523

3. Marchanka, Simon, Carlomagno “A Suite of solid-state NMR experiments for RNA intranucleotide resonance assignment in a 21 kDa protein-RNA complex” Angewandte Chemie 2013 52, 9996-10001

4.  Marchanka, Simon, Althoff-Ospelt, Carlomagno “RNA structure determination by solid-state NMR spectroscopy” Nature Communications, 2015 doi: 10.1038/ncomms8024